IUPAC mendefinisikan kromatografi sebagai metode pemisahan campuran dimana komponen yang akan dipisahkan, didistribusikan antara dua fasa yaitu, fasa diam dan fasa bergerak dalam arah tertentu. Fasa bergerak adalah fluida yang bergerak/ merembes di sepanjang fasa diam pada arah tertentu. Fluida dapat berupa cairan, gas, cairan superkritis. Fasa diam dapat berupa solid, gel, atau cairan. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu, liquid kromatografi dan gas kromatografi.
Kromatografi cair (LC) adalah teknik kromatografi analisis yang berguna untuk memisahkan ion atau molekul yang dilarutkan dalam pelarut (fasa bergerak berupa cairan). Jika larutan sampel kontak dengan fasa cair, zat terlarut yang berbeda akan berinteraksi dengan fase lain hingga derajat yang berbeda karena perbedaan dalam adsorpsi, pertukaran ion, partisi, atau ukuran. Perbedaan ini memungkinkan komponen campuran untuk dipisahkan satu sama lain berdasarkan waktu transit dari zat terlarut melalui kolom. Jenis kromatografi sangat banyak berdasarkan fase diam dan fase bergeraknya juga efisiensi dan performa karakterisasinya.
Walaupun liquid kromatografi (LC) ditemukan lebih dulu dari kromatorafi gas (GC), penggunaannya lebih mendominasi bahkan untuk aplikasi sederhana. LC dapat digunakan pada pemisahan senyawa apa sanya yang bisa terlarut dalam fase liquid. Untuk aplikasi biologis, polimer sintetis dan alami, juga senyawa inorganik LC lebih unggul. Selain itu, adanya fase bergerak membuat LC dapat digunakan pada suhu lebih rendah dari GC. Sehingga LC lebih sesuai untuk memisahkan sampel yang peka suhu. Tidak seperti GC, LC lebih fleksible dalam pengoptimalan proses pemisahan dan kebanyakan detektor LC tidak merusak. Salah satu kekurangan LC dibanding GC adalah resolusinya. Yang termasuk liquid kromatografi diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis, LPLC, dan HPLC.
Kromatografi cair (LC) adalah teknik kromatografi analisis yang berguna untuk memisahkan ion atau molekul yang dilarutkan dalam pelarut (fasa bergerak berupa cairan). Jika larutan sampel kontak dengan fasa cair, zat terlarut yang berbeda akan berinteraksi dengan fase lain hingga derajat yang berbeda karena perbedaan dalam adsorpsi, pertukaran ion, partisi, atau ukuran. Perbedaan ini memungkinkan komponen campuran untuk dipisahkan satu sama lain berdasarkan waktu transit dari zat terlarut melalui kolom. Jenis kromatografi sangat banyak berdasarkan fase diam dan fase bergeraknya juga efisiensi dan performa karakterisasinya.
Walaupun liquid kromatografi (LC) ditemukan lebih dulu dari kromatorafi gas (GC), penggunaannya lebih mendominasi bahkan untuk aplikasi sederhana. LC dapat digunakan pada pemisahan senyawa apa sanya yang bisa terlarut dalam fase liquid. Untuk aplikasi biologis, polimer sintetis dan alami, juga senyawa inorganik LC lebih unggul. Selain itu, adanya fase bergerak membuat LC dapat digunakan pada suhu lebih rendah dari GC. Sehingga LC lebih sesuai untuk memisahkan sampel yang peka suhu. Tidak seperti GC, LC lebih fleksible dalam pengoptimalan proses pemisahan dan kebanyakan detektor LC tidak merusak. Salah satu kekurangan LC dibanding GC adalah resolusinya. Yang termasuk liquid kromatografi diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis, LPLC, dan HPLC.
Pada kromatografi kertas fase diam adalah kertas serap dan fase gerak adalah pelarut. Jarak relatif pada pelarut disebut sebagai nilai Rf , yaitu jarak tempuh senyawa dibagi dengan jarak tempuh pelarut.
Kromatografi liquid sederhana (LPLC/ Low Performance Liquid Chromatography) terdiri dari sebuah kolom dengan dasar fritted yang menjaga fasa tetap berada dalam keseimbangan dengan pelarut. Dengan pelarut dan kondisi yang sesuai, komponen-komponen berbeda dalam campuran akan lewat dengan kecepatan berbeda di sepanjang kolom dari komponen lainnya sehingga terjadi pemisahan yang diinginkan dikarenakan perbedaan sifat partisi antara fase tetap dan fase bergerak cair.
Misalnya, kita ingin memisahkan sebuah campuran yang jika ditambahkan pelarut akan menghasilkan warna berbeda. Warna larutan awal adalah hijau. Pertama, penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang berada di kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas. Kemudian, campuran dimasukan dengan hati-hati dari bagian atas kolom. Setelah itu, kran dibuka lagi agar campuran berwarna diserap pada bagian atas material terpadatkan. Karena pelarut mengalir secara terus-menerus, pelarut baru perlu ditambahkan melalui bagian atas kolom dengan tidak merusak material terpadatkan dalam kolom, sehingga kolom tidak pernah kering. Pelarut yang mengalir dikumpulkan dalam satu gelas kimia. Seperti telah dijelaskan sebelumnya, komponen campuran akan lewat dengan kecepatan berbeda (zat warna biru dan kuning).
Yang telah dijelaskan diatas adalah metode liquid kromatografi konvensional. Liquid kromatografi konvensional biasanya digunakan untuk menisahkan atau memurnikan beberapa komponen dari sebuah campuran. Analisa pemisahan sampel untuk deteksi atau analisa kuantitatif biasanya digunakan HPLC, sebuah metode liquid kromatografi yang lebih canggih. HPLC memiliki kecepatan, resolusi dan sensitivitas detektor lebih baik. Ideal digunakan untuk zat bermolekul besar dan berionik. Selain itu rekoveri sampel mudah dilakukan. Pada HPLC digunakan ssebuah pompa untuk mendorong fasa bergerak sehingga resolusi lebih baik dan waktu analisis lebih singkat.
Misalnya, kita ingin memisahkan sebuah campuran yang jika ditambahkan pelarut akan menghasilkan warna berbeda. Warna larutan awal adalah hijau. Pertama, penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang berada di kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas. Kemudian, campuran dimasukan dengan hati-hati dari bagian atas kolom. Setelah itu, kran dibuka lagi agar campuran berwarna diserap pada bagian atas material terpadatkan. Karena pelarut mengalir secara terus-menerus, pelarut baru perlu ditambahkan melalui bagian atas kolom dengan tidak merusak material terpadatkan dalam kolom, sehingga kolom tidak pernah kering. Pelarut yang mengalir dikumpulkan dalam satu gelas kimia. Seperti telah dijelaskan sebelumnya, komponen campuran akan lewat dengan kecepatan berbeda (zat warna biru dan kuning).
Yang telah dijelaskan diatas adalah metode liquid kromatografi konvensional. Liquid kromatografi konvensional biasanya digunakan untuk menisahkan atau memurnikan beberapa komponen dari sebuah campuran. Analisa pemisahan sampel untuk deteksi atau analisa kuantitatif biasanya digunakan HPLC, sebuah metode liquid kromatografi yang lebih canggih. HPLC memiliki kecepatan, resolusi dan sensitivitas detektor lebih baik. Ideal digunakan untuk zat bermolekul besar dan berionik. Selain itu rekoveri sampel mudah dilakukan. Pada HPLC digunakan ssebuah pompa untuk mendorong fasa bergerak sehingga resolusi lebih baik dan waktu analisis lebih singkat.
Pada prinsipnya, HPLC teridiri dari tempat pelarut, pompa (untuk mengalirkan pelarut), tempat injeksi sampel, kolom (berisi padatan fase tetap), detektor, dan rekorder.
Fase bergerak atau pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing terlebih dahulu untuk mengeluarkan gas yang terlarut yang tidak diinginkan. Dalam pemilihannya harus diperhatikan kemurnian dari pelarut, kompatibilitas dengan detektor, kelarutan sampel, inert atau tidak, viskositas yang rendah, dan tentunya harga yang sesuai.
Pompa yang digunakan bertekanan tinggi. Digunakan pengendali aliran aliran untuk menstabilkan aliran pelarut akibat adanya perubahan tekanan gas, temperatur, dan viskositas. Ada dua jenis pompa yang mendasari pemakaiannya yaitu, tekanan tetap dan volum tetap. Pompa bolak-balik dengan piston akan menarik pelarut (fase bergerak) dan membawanya ke kolom.
Jarum injektor (10-500µ) digunakan untuk memasukan sampel ke sampel loop. Sampel yang dibutuhkan hanya sedikit. Dengan rotasi loop sebesar 60o, pompa akan memasukan sampel ke kolom dengan arah berlawanan dari saat sampel dimasukan.
Pompa yang digunakan bertekanan tinggi. Digunakan pengendali aliran aliran untuk menstabilkan aliran pelarut akibat adanya perubahan tekanan gas, temperatur, dan viskositas. Ada dua jenis pompa yang mendasari pemakaiannya yaitu, tekanan tetap dan volum tetap. Pompa bolak-balik dengan piston akan menarik pelarut (fase bergerak) dan membawanya ke kolom.
Jarum injektor (10-500µ) digunakan untuk memasukan sampel ke sampel loop. Sampel yang dibutuhkan hanya sedikit. Dengan rotasi loop sebesar 60o, pompa akan memasukan sampel ke kolom dengan arah berlawanan dari saat sampel dimasukan.
Kolom HPLC memiliki diameter sangat kecil (2-10mm) dan biasanya digunakan material yang reuseable seperti stainless steel. Kolom tidak memerlukan temperatur yang tinggi karena sifat ikatan kimia terhadap fase tetap sangat tinggi. Ukuran kolom sangat beragam tergantung dari sampel yang digunakan, diantaranya 10, 15, dan 25 cm panjang; 3, 5, dan 10 mm diameter luar; 4-4,6mm diameter dalam.
Fase tetap pada HPLC biasanya partikel berukuran 3-10µ yang terpadatkan dengan ukuran pori 70-300Å. Luas permukaannya 50-250 m2/g. Terkadang digunakan surface coating pada fase tetap, diantaranya yang biasa digunakan adalah -Si-OH dan -NH2 (fase normal), C8, C18, dan fenil (fase kebalikan), -NH4+ (pertukaran anion), dan -COO-(pertukaran kation).
Secara umum detektor untuk HPLC harus memiliki sensitivitas tinggi, respon menyeluruh terhadap sampel, tidak merusak sampel, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fase bergerak, dan dapar beroperasi secara terus menerus. Beberapa detektor HPLC yang umum digunakan dikategorikan menjadi dua, universal dan selektif.
Detektor universal diantaranya: refractive index (RI), sampel akan mengubah indeks refraksi proporsional dengan konsentrasinya dengan temperatur dijaga sebab perubahan temperatur dapat mengubah indeks refraksi, ideal untuk menganalisa senyawa kompleks seperti gula dan karbohidrat; evaporative light scattering detector (ELSD), penghamburan cahaya sebagai respon dari partikel analit, lebih sensitif dari RI; mass spectroscopy (MS), paling banyak digunakan dan banyak jenisnya.
Detektor selektif diantaranya: UV/VIS light, mendeteksi molekul dengan kromofor (254nm); fluorescence, sinyal terhadap noise lebih tinggi dari UV/VIS dan lebih sensitif, baik untuk analisa senyawa turunan; electrochemical (ECD), fase bergerak membawa muatan elektrolit yang mengeliminasi fase normal, baik untuk sampel yang teroksidasi atau tereduksi pada permukaan elektroda.
Output dari detektor akan dikeluarkan oleh rekorder dalam bentuk kromatogram.
Fasa tetap yang umum (dan interaksinya dengan zat terlarut) adalah: padatan (adsorpsi), kelompok ion pada resin (ion-exchange), dan cairan pada dukungan solid inert (partisi).
Fase tetap pada HPLC biasanya partikel berukuran 3-10µ yang terpadatkan dengan ukuran pori 70-300Å. Luas permukaannya 50-250 m2/g. Terkadang digunakan surface coating pada fase tetap, diantaranya yang biasa digunakan adalah -Si-OH dan -NH2 (fase normal), C8, C18, dan fenil (fase kebalikan), -NH4+ (pertukaran anion), dan -COO-(pertukaran kation).
Secara umum detektor untuk HPLC harus memiliki sensitivitas tinggi, respon menyeluruh terhadap sampel, tidak merusak sampel, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fase bergerak, dan dapar beroperasi secara terus menerus. Beberapa detektor HPLC yang umum digunakan dikategorikan menjadi dua, universal dan selektif.
Detektor universal diantaranya: refractive index (RI), sampel akan mengubah indeks refraksi proporsional dengan konsentrasinya dengan temperatur dijaga sebab perubahan temperatur dapat mengubah indeks refraksi, ideal untuk menganalisa senyawa kompleks seperti gula dan karbohidrat; evaporative light scattering detector (ELSD), penghamburan cahaya sebagai respon dari partikel analit, lebih sensitif dari RI; mass spectroscopy (MS), paling banyak digunakan dan banyak jenisnya.
Detektor selektif diantaranya: UV/VIS light, mendeteksi molekul dengan kromofor (254nm); fluorescence, sinyal terhadap noise lebih tinggi dari UV/VIS dan lebih sensitif, baik untuk analisa senyawa turunan; electrochemical (ECD), fase bergerak membawa muatan elektrolit yang mengeliminasi fase normal, baik untuk sampel yang teroksidasi atau tereduksi pada permukaan elektroda.
Output dari detektor akan dikeluarkan oleh rekorder dalam bentuk kromatogram.
Fasa tetap yang umum (dan interaksinya dengan zat terlarut) adalah: padatan (adsorpsi), kelompok ion pada resin (ion-exchange), dan cairan pada dukungan solid inert (partisi).
- Adsorpsi, adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran dengan cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian adsorben cair yang diikuti dengan pelarutan. Bahan yang dijadikan adsorben harus selektif, memiliki tekanan uap rendah, tidak korosif, mempunyai viskositas yang rendah, stabil secara termis, murah, dan memiliki daya melarutkan bahan yang akan diadsorpsi sebesar mungkin. Dengan demikian kebutuhan akan cairan lebih sedikit dan volum alat menjadi lebih kecil. Teknik ini cocok untuk senyawa nonpolar yang kecil (berat molekul<5000). Keuntungan metode ini adalah dapat memisahkan dan menahan beberapa senyawa yang tidak bisa dilakukan dengan metode lainnya, misalnya pada pemisahan isomer geometri. Mekanismenya dapat dilihat pada gambar berikut, zat terlarut A mengangkat n molekul dari pelarut M dari permukaannya.
- Ion-exchange, digunakan untuk memisahkan sejumlah anion dan kation. Anorganik kation dipisahkan pada kolom resin pemisah kation. Sementara anorganik anion dipisahkan pada kolom resin pemisah anion.
- Partisi cair-cair, tergantung dari partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang lainnya sebagai fase bergerak. Bahan yang digunakan biasanya adalah silika. Mekanismenya diberikan oleh hubungan berikut.
Untuk melakukan analisa kualitatif dengan liquid kromatografi dasarnya adalah waktu retensi atau volum retensi suatu senyawa. Kemudian t atau V senyawa dalam sampel dibandingkan dengan t atau V suatu senyawa standar yang telah diketahui sebelumnya. Rasio waktu retensi dari dua komponen atau selektifitas dapat dihitung dengan cara berikut:
Sementara untuk analisa kuantitatif ada beberapa metode yang perlu diketahui diantaranya adalah sebagai berikut:
- Metode pengukuran tinggi puncak.
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu segitiga yaitu, suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.
- Metode pengukuran luas puncak.
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu, 1/2 x alas x tinggi. Rumus tersebut memberikan hasill yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain untuk bentuk kromatogram yang lain yaitu, tinggi x lebar pada 1/2 puncak.
- Metode gunting dan timbang.
Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan ini ditimbang. Berat dari masing-masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.
- Metode integrator.
Integrator emrupakan alat elektronik yang sering dijumpai pada peralatan kromatografi modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram yang dibentuk secara elektronik.
Area di bawah puncak sebanding dengan jumlah zat x yang terdeteksi. Jika larutan kurang pekat, area di bawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi sama. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah puncak. Area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding area di bawah puncak X dapat berarti: Y lebih sedikit dari X; bisa juga erarti jumlahnya sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang yang lebih sedikit dibanding X.
